霍亂弧菌
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點(diǎn)狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜。共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂。
霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫傳染病。
簡介
弧菌屬(Vibrio)中霍亂弧菌(V．cholerae)、引起一種烈性腸道傳染病，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)、病死率高，屬于國際檢疫傳染病。
霍亂弧菌包括兩個生物型：古典生物型（Classical biotype）和埃爾托生物型（EL-Tor bio-type）。這兩種型別除個別生物學(xué)性狀稍有不同外，形態(tài)和免疫學(xué)性基本相同，在臨床病理及流行病學(xué)特征上沒有本質(zhì)的差別。自1817年以來，全球共發(fā)生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第七次病原是埃爾托型所致。
1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集，抗01群的抗血清對0139菌株無保護(hù)性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株。
性狀
形態(tài)與培養(yǎng)特性
新從病人分離出古典型霍亂弧菌和ELtor弧菌比較典型，為革蘭氏陰性菌，菌體彎曲呈弧狀或逗點(diǎn)狀，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無莢膜與芽胞。經(jīng)人工培養(yǎng)后，易失去弧形而呈桿狀。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細(xì)菌運(yùn)動極為活潑，呈流星穿梭運(yùn)動。在液體培養(yǎng)基內(nèi)常呈單個、成對成鏈狀，有的相連呈S形，甚至螺旋狀。
營養(yǎng)要求不高，在PH8.8～9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長良好。因其他細(xì)菌在這一PH不易生長，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養(yǎng)基。在堿性平板上菌落直徑為2mm,圓形，光滑，透明。
霍亂弧菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，靛基質(zhì)反應(yīng)陽性，當(dāng)培養(yǎng)在含硝酸鹽及色氨酸的培養(yǎng)基中，產(chǎn)生靛基質(zhì)與亞硝酸鹽，在濃硫酸存在時，生成紅色，稱為霍亂紅反應(yīng)，但其他非致病性弧菌亦有此反應(yīng)，故不能憑此鑒定霍亂弧菌。EL Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應(yīng)有所不同。前者Vp陽性而后者為陰性。前者能產(chǎn)生強(qiáng)烈的溶血素，溶解羊紅細(xì)胞，在血平板上生長的菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)，古典型霍亂弧菌則不溶解羊紅細(xì)胞。個別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。
抗原性
根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）。
抵抗力
霍亂弧菌古典生物型對外環(huán)境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強(qiáng)，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鮮魚，貝殼類食物上存活1～2周。
霍亂弧菌對熱，干燥，日光，化學(xué)消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿。濕熱55℃，15分鐘，100℃，1～2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死。0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達(dá)到消毒目的。在正常胃酸中僅生存4分鐘。
檢測方法
生化鑒定
能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣，遲緩發(fā)酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水楊素、衛(wèi)矛醇、鼠李糖、木糖、側(cè)金盞花醇和肌醇。氧化酶、明膠液化試驗(yàn)陽性。V-P試驗(yàn)大多數(shù)EL-Tor生物型陽性，而古典生物型大多為陰性；魜y弧菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，同時能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。因此當(dāng)霍亂弧菌培養(yǎng)在含硝酸鹽的蛋白胨水中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽與吲哚結(jié)合成亞硝基吲哚，滴加濃硫酸即出現(xiàn)薔薇色，稱為霍亂紅試驗(yàn)陽性。
血清凝集法
根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）。
1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集，抗01群的抗血清對0139菌株無保護(hù)性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株，推薦使用天津生物芯片生產(chǎn)的霍亂弧菌診斷血清。
聚合酶鏈反應(yīng)法
1,普通聚合酶鏈反應(yīng)法
核酸擴(kuò)增技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是設(shè)計、合成兩條寡核苷酸，作為引物，對應(yīng)于待測病原微生物某一段特異性序列的兩端，然后在體外模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的過程反復(fù)擴(kuò)增，使靶序列放大上萬倍甚至上百萬倍而被檢測出來。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來源的菌株)有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達(dá)調(diào)控基因(toxR)等也被選用為PcR的靶基因，這大大提高了檢測的特異度.
2 ,多重PCR法
與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應(yīng)可檢測多個基因，節(jié)省了時間和成本。國內(nèi)、外許多學(xué)者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進(jìn)行組合，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PcR同時可準(zhǔn)確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測效率。
3.熒光定量PCR法
熒光定量PCR自動化程度高、特異性強(qiáng)、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應(yīng)用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設(shè)計更精確、多通道熒光PCR儀的開發(fā)與廣泛使用，多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應(yīng)用的熱點(diǎn).
基因芯片
與PCR方法相比，基因芯片技術(shù)能同時獲得更多病原學(xué)、生物學(xué)方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運(yùn)用基因芯片技術(shù)對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進(jìn)行全面分析，對掌握這些細(xì)菌的致病性及進(jìn)行有效預(yù)防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應(yīng)用尚需時間等待。
癥狀
人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經(jīng)口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進(jìn)入小腸后，依靠鞭毛的運(yùn)動，穿過粘膜表面的粘液層，可能藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細(xì)胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經(jīng)過短暫的潛伏期后便急驟發(fā)病。該菌不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產(chǎn)生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細(xì)胞與腸腺使腸液過度分泌，從而患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”并含大量弧菌，此為本病典型的特征。
霍亂腸毒素本質(zhì)是蛋白質(zhì)，不耐熱，56℃經(jīng)30分鐘，即可破壞其活性。對蛋白酶敏感而對胰蛋白酶抵抗。該毒素屬外毒素，具有很強(qiáng)的抗原性，F(xiàn)已能將該毒素高度精制成晶狀，仍保持極強(qiáng)的生物學(xué)活性。霍亂腸毒素致病機(jī)理如下：毒素由A和B兩個亞單位組成，A亞單位又分為A1和A2兩個肽鏈，兩者依靠二硫鏈連接。A亞單位為毒性單位，其中A1肽鏈具有酶活性，A2肽鏈與B亞單位結(jié)合參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中的轉(zhuǎn)位作用。B亞單位為結(jié)合單位，能特異地識別腸上皮細(xì)胞上的受體。1個毒素分子由一個A亞單位和4~6個B亞單位組成多聚體；魜y腸毒素作用于腸細(xì)胞膜表面上的受體（由神經(jīng)節(jié)苷脂GM1組成），其B亞單位與受體結(jié)合，使毒素分子變構(gòu)，A精致單位進(jìn)入細(xì)胞，A1肽鏈活化，進(jìn)而激活腺苷環(huán)化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷（cAMP），細(xì)胞內(nèi) cAMP濃度增高，導(dǎo)致腸粘膜細(xì)胞分泌功能大為亢進(jìn)，使大量體液和電解質(zhì)進(jìn)入腸腔而發(fā)生劇烈吐瀉，由于大量脫水和失鹽，可發(fā)生代謝性酸中毒，血循環(huán)衰竭，甚至休克或死亡。
致病因素
霍亂弧菌產(chǎn)生腸毒素，是一種劇烈的致泄毒素。該毒素作用于腸壁促使腸黏膜細(xì)胞極度分泌從而使水和鹽過量排出，導(dǎo)致嚴(yán)重脫水虛脫；進(jìn)而引起代謝性酸中毒和急性腎功能衰竭 。
所致疾病
引起烈性腸道傳染病霍亂，為我國的甲類法定傳染病。在自然情況下，人類是霍亂弧菌的唯一易感者。在地方性流行區(qū)，除病人外，無癥狀感染者也是重要傳染源。高比例的無癥狀攜帶者有利于疾病的擴(kuò)散，根據(jù)衛(wèi)生狀況，無癥狀攜帶者和病人的比率波動在10:1～100:1之間。
傳播途徑主要是通過污染的水源或未煮熟的食物如海產(chǎn)品、蔬菜經(jīng)口攝入。居住擁擠，衛(wèi)生狀況差，特別是公用水源是造成暴發(fā)流行的重要因素。人與人之間的直接傳播不常見。在正常胃酸條件下，如以水為載體，需飲入大于1010個細(xì)菌方能引起感染；如以食物作為載體，由于食物高強(qiáng)度的緩沖能力，感染劑量可減少到102～104個細(xì)菌。任何能降低胃中酸度的藥物或其他原因，都可使人對霍亂弧菌感染的敏感性增加。
病菌到達(dá)小腸后，粘附于腸粘膜表面并迅速繁殖，不侵入腸上皮細(xì)胞和腸腺，細(xì)菌在繁殖過程中產(chǎn)生腸毒素而致病。O1群霍亂弧菌感染可從無癥狀或輕型腹瀉到嚴(yán)重的致死性腹瀉。在古典生物型霍亂弧菌感染中，無癥狀者可達(dá)60%，在El Tor生物型感染中，無癥狀者可達(dá)75%；魜y弧菌古典生物型所致疾病較El Tor生物型嚴(yán)重。典型病例一般在吞食細(xì)菌后2～3天突然出現(xiàn)劇烈腹瀉和嘔吐，多無腹痛，每天大便數(shù)次或數(shù)十次。在疾病最嚴(yán)重時，每小時失水量可高達(dá)1升，排出由粘膜、上皮細(xì)胞和大量弧菌構(gòu)成的如米泔水樣的腹瀉物。由于大量水分和電解質(zhì)喪失而導(dǎo)致失水，代謝性酸中毒，低堿血癥和低容量性休克及心力不齊和腎衰竭，如未經(jīng)治療處理，病人可在12～24小時內(nèi)死亡，死亡率高達(dá)25%～60%，但若及時給病人補(bǔ)充液體及電解質(zhì)，死亡率可小于1%。O139群霍亂弧菌感染比O1群嚴(yán)重，表現(xiàn)為嚴(yán)重脫水和高死亡率，且成人病例所占比例較高，大于70%，而O1群霍亂弧菌流行高峰期，兒童病例約占60%。
病愈后一些患者可短期帶菌，一般不超過3～4周，真正的慢性帶菌者罕見。病菌主要存在于膽囊中。
免疫性
患過霍亂的人可獲得牢固的免疫力，再感染者少見。病人在發(fā)病數(shù)日，血液中即可出現(xiàn)特異性抗體，7℃14天抗體滴度達(dá)高峰，隨后逐漸下降至較低水平，但能持續(xù)約3個月之外。病后小腸內(nèi)可出現(xiàn)分泌型lgA。體液抗體與免疫的關(guān)系尚不清楚，一般認(rèn)為局部SlgA可在腸粘膜與病菌之間形成免疫屏障，有阻斷粘附和中和毒素的作用。
診斷
由于霍亂流行迅速，且在流行期間發(fā)病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對治療和預(yù)防本病的蔓延有重大意義。
直接鏡檢
采取病人“米泔水樣”大便或嘔吐物。鏡檢（涂片染色及懸滴法檢查）觀察細(xì)菌形態(tài)，動力特征。
細(xì)菌分離培養(yǎng)
可將材料接種至堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)6～8小時后，取生長物作形態(tài)觀察，并轉(zhuǎn)種于堿性平板作分離培養(yǎng)，取可疑菌落作玻片凝集，陽性者再作生化反應(yīng)及生物型別鑒定試驗(yàn)。
特異性制動試驗(yàn)
取檢材或新鮮堿性蛋白胨水培養(yǎng)物一滴，置于載玻片上，再加霍亂弧菌多價診斷血清，加蓋玻片，用暗視野鏡觀察，3分鐘內(nèi)運(yùn)動被抑制的即為陽性，此法優(yōu)點(diǎn)是快速而特異操作簡便，但必須有數(shù)量較多的弧菌才檢出。
免疫熒光試驗(yàn)
除一般免疫熒光法外，還可用熒光菌球法檢查。
特征
霍亂弧菌所致的霍亂，為烈性腸道傳染病，曾在世界上發(fā)生過幾次大流行，至今仍未平息，因此，霍亂被列為國境檢疫的傳染病。
霍亂弧菌有兩個生物型，一為古典生物型，一為愛爾托生物型，這兩個生物型在形態(tài)及血清學(xué)性狀方面幾乎相同，可作第四組霍亂噬菌體裂解試驗(yàn)，多粘菌素B敏感試驗(yàn)，雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，V-P(服-潑)二氏試驗(yàn)等試驗(yàn)加以鑒別：
本菌是需氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好；魜y弧菌具有耐堿性，故常用堿性(pH值8.4～9.2)培養(yǎng)基選擇性分離培養(yǎng)本菌。在堿性瓊脂平板上生長后，呈水滴樣光滑型菌落，而在堿性蛋白胨液體培養(yǎng)基中，生長迅速，培養(yǎng)6～8小時即可形成菌膜，利用這一特點(diǎn)，可以作快速增菌，進(jìn)行鑒定。在慶大霉素瓊脂平板上，生長快，8～10小時能生長出小菌落，可供鑒定用；魜y弧菌能分解蔗糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解阿拉伯膠糖。
霍亂弧菌在未經(jīng)處理的糞便中，可存活數(shù)天；在冰箱內(nèi)的牛奶、鮮肉和魚蝦水產(chǎn)品中存活時間分別為2～4周、1周和1～3周；在室溫下存放的新鮮蔬菜中，可存活1～5天；在砧板和布上可存活相當(dāng)長時間；在玻璃、瓷器、塑料和金屬上存活時間不超過2天；魜y弧菌古典生物型在外界環(huán)境中生存能力不強(qiáng)，而愛爾托生物型抵抗力較強(qiáng)，在河水、井水、池塘水和海水中可存活1～3周，甚至更長，有時在局部自然水中也能越冬。愛爾托生物型弧菌可粘附于海洋甲殼類生物表面，分泌甲殼酶，分解甲殼作為營養(yǎng)而長期存活，如愛爾托生物型弧菌被人工飼養(yǎng)的泥鰍、鱔魚吞食后，可在其體內(nèi)生長繁殖，然后排入水中。
霍亂弧菌對熱、干燥、日光及一般消毒劑均很敏感，經(jīng)干燥2小時或加熱55℃10分鐘即可死亡，煮沸立即死亡；對酸敏感，在正常胃酸中僅能存活4分鐘，接觸1∶5000～1∶10000鹽酸或硫酸、1∶2000～1∶3000升汞或1∶500000高錳酸鉀，數(shù)分鐘即被殺滅，在0.1%漂白粉中10分鐘內(nèi)即可死亡。氯化鈉的濃度高于4%或蔗糖濃度在5%以上的食物、香料、醋及酒等，均不利于霍亂弧菌的生存。
發(fā)病機(jī)制
正常胃酸可殺滅霍亂弧菌，當(dāng)胃酸分泌缺乏或低下，或入侵的霍亂弧菌數(shù)量較多，未被殺滅的弧菌就進(jìn)入小腸，在堿性腸液內(nèi)迅速繁殖，并通過粘液對細(xì)菌的趨化吸引作用、細(xì)菌鞭毛活動及弧菌粘蛋白溶解酶和粘附素等的作用，粘附于小腸粘膜的上皮細(xì)胞表面，并在此大量繁殖。
此菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素，即霍亂腸毒素，由A亞單位和B亞單位組成。B亞單位與該處粘膜上皮細(xì)胞表面受體——神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，A、B兩種亞單位解離，A亞單位穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷含量提高，促使一系列酶反應(yīng)加速進(jìn)行，導(dǎo)致空腸到回腸部腺細(xì)胞分泌功能亢進(jìn)，引起大量液體及血漿中的鈉、鉀、氯等離子進(jìn)入腸腔，由于分泌功能超過腸道再吸收能力，從而造成嚴(yán)重的腹瀉及嘔吐；由于膽汁分泌減少，且腸腔中有大量水、粘液及電解質(zhì)，故排瀉物呈白色“米泔水”樣；由于劇烈吐瀉，導(dǎo)致脫水和電解質(zhì)丟失，引起缺鉀、缺鈉及肌肉痙攣；由于碳酸氫根離子丟失，酸性代謝物在體內(nèi)蓄積，引起代謝性酸中毒；由于有效血容量急劇減少，血液濃縮，導(dǎo)致尿量減少、血壓下降，甚至休克；由于腎缺血、缺氧，細(xì)胞內(nèi)缺鉀，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，造成急性腎功能衰竭。
主要病變均由嚴(yán)重脫水引起，臨床可見指紋皺縮，皮下組織及肌肉干癟。心、肝、脾等臟器均見縮小。內(nèi)臟漿膜無光澤。腸腔高度擴(kuò)張、腸內(nèi)充滿泔水樣液體，腸粘膜松弛，但粘膜上皮完整，無潰瘍。膽囊內(nèi)充滿粘稠膽汁。腎小球及間質(zhì)的毛細(xì)管擴(kuò)張，腎小管腫脹、變性及壞死。其他臟器也有出血、變性等變化。
防治原則
必須貫徹預(yù)防為主的方針，作好對外交往及入口的檢疫工作，嚴(yán)防本菌傳入，此外應(yīng)加強(qiáng)水、糞管理，注意飲食衛(wèi)生。對病人要嚴(yán)格隔離，必要時實(shí)行疫區(qū)封鎖，以免疾病擴(kuò)散蔓延。
人群的菌苗預(yù)防接種，可獲良好效果，用加熱或化學(xué)藥品殺死的古典型霍亂菌苗皮下接種，能降低發(fā)病率。這種苗菌對EL-Tor型霍亂弧菌感染也有保護(hù)作用，但持續(xù)時間短，僅3-6個月？诜䌷BS/WC疫苗（重組B亞單位/霍亂菌體疫苗）可用于預(yù)防霍亂，2000年WHO關(guān)于霍亂疫苗的意見書提出，“應(yīng)考慮對有罹患霍亂危險性的人群使用rBS/WC疫苗”。該疫苗對霍亂的保護(hù)期為3年，國內(nèi)有上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司生產(chǎn)rBS/WC疫苗。
治療主要為及時補(bǔ)充液體和電解質(zhì)及應(yīng)用抗菌藥物如鏈霉素、氯霉素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方SMZ-TMP等。
